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      馬鈴薯Y病毒(PVY)ELISA試劑盒說明書
      更新時(shí)間:2016-10-12 點(diǎn)擊量:560

      馬鈴薯Y病毒(PVY)酶聯(lián)免疫分析(ELISA

      試劑盒使用說明書

      本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于檢測馬鈴薯組織,細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中Y病毒(PVY)水平。

      實(shí)驗(yàn)原理

        本試劑盒用雙抗夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)測定標(biāo)本馬鈴薯Y病毒(PVY)。用純化的馬鈴薯Y病毒(PVY)抗體包被微孔板,制成固相抗,可與樣品中馬鈴薯Y病毒(PVY)相結(jié)合,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的馬鈴薯Y病毒(PVY)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中馬鈴薯Y病毒(PVY)的存在與否。

       

      試劑盒組成

      試劑盒組成

      48孔配置

      96孔配置

      保存

      說明書

      1份

      1份

       

      封板膜

      2片(48)

      2片(96)

       

      密封袋

      1個(gè)

      1個(gè)

       

      酶標(biāo)包被板

      1×48

      1×96

      2-8℃保存

      陰性對照

      0.5ml×1瓶

      0.5ml×1瓶

      2-8℃保存

      陽性對照

      0.5ml×1瓶

      0.5ml×1瓶

      2-8℃保存

      酶標(biāo)試劑

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      樣品稀釋液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      顯色劑A液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      顯色劑B液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      終止液

      3ml×1瓶

      6ml×1瓶

      2-8℃保存

      濃縮洗滌液

      (20ml×20倍)×1瓶

      (20ml×30倍)×1瓶

      2-8℃保存

       

      樣本處理及要求

      1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

      2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

      3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

      4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

      5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

      6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

      7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

       

      操作步驟

      • 編號:將樣品對應(yīng)微孔按序編號,每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)
      • 加樣:分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,
      • 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
      • 配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
      • 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
      • 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。
      • 溫育:操作同3。
      • 洗滌:操作同5。
      • 顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘
      • 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)
      • 測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

       

      結(jié)果判定:

        試驗(yàn)有效性:陽性對照孔平均值1.00; 陰性對照平均值0.10

        臨界值(CUT OFF)計(jì)算:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

        陰性判定:樣品OD值< 臨界值(CUT OFF)者為馬鈴薯Y病毒(PVY)陰性

        陽性判定:樣品OD值 臨界值(CUT OFF)者為馬鈴薯Y病毒(PVY)陽性

      注意事項(xiàng)

      1.操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,本試劑不同批號組分不得混用。

      2.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

      3.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

      • 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

      5.底物請避光保存。

      6.試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),使用雙波長檢測時(shí),參考波長為630nm

      7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸,使用時(shí)必須注意安全。

       

      保存條件及有效期

      1.試劑盒保存:;2-8。

      2.有效期:6個(gè)月

      滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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