大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析
- 細菌分離純化:無菌采集肝臟劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,伊美蘭瓊脂培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)12-24h,用普通培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng);
- 細菌形態(tài)特征:無菌挑去上述純化培養(yǎng)菌,革蘭氏染色鏡檢
電鏡觀察:FQ-180菌液培養(yǎng)7h后,3000r/min離心5min,棄上清,ddH2O洗滌2次重懸,取15ul滴在Formver膜覆蓋在銅網(wǎng)上,2min后滴加磷鎢酸負染2min,待銅網(wǎng)烘干后,在投射電子顯微鏡下觀察
- 生化試驗:將初步分離到的可疑菌落進行吲哚試驗,MR試驗,VP試驗,淀粉E試驗,枸櫞酸鈉利用試驗,乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇發(fā)酵試驗,產(chǎn)硫化氫試驗,尿素酶試驗,觸酶試驗,運動性試驗,三塘鐵斜面穿刺試驗(或用ATB全自動生化鑒定系統(tǒng)和ID32E腸道菌鑒定試劑條進行生化試驗)
- 藥敏試驗:按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行實驗操作和結(jié)果判斷(所采用的抗生素見圖1)
- 血清型鑒定:采用玻板凝集反應對分離株進行血清型鑒定,先用多因子血清通過玻板凝集試驗篩選可能的血清型,然后再與大腸桿菌單因子血清各10ul在玻板上混勻,30S內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應,同時以菌液與0.5%碳酸生理鹽水混合物作對照,觀察有無自凝現(xiàn)象
- PCR鑒定:將分離純化后的菌株按照煮沸法制備細菌DNA模板,以大腸桿菌phoA基因的特異性引物進行PCR鑒定
- 毒力基因與耐藥性的關(guān)系:根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果,針對藥敏性較為普遍的抗生素的耐藥基因情況,找出其規(guī)律,并研究獨立基因與耐藥性的關(guān)系,然后采用多重PCR方法檢測耐藥基因,如4種氨基糖苷類耐藥基因aadA1,aac2,aac4,aphA3;3種四環(huán)素類耐藥性基因tetA,tetC以及tetM的流行情況
- 提取DNA及16s rDNA鑒定:提取細菌基因組DNA,并使用16s rRNA Bacterial Identification PCR kit的特異性引物進行擴增,后進一步對PCR擴增的DNA克隆、測序并開展序列分析
- 致病性試驗:參照A.E.Williams等方法,設(shè)置16組試驗組,1組陰性對照,實驗組每株菌攻毒4只小組,按0.2ul/只腹腔注射菌液濃度為1*109ef/ml,對照組4只小鼠注射等劑量的生理鹽水,觀察發(fā)病及死亡情況,無菌采集死亡小鼠肝臟、心臟進行分離鑒定
- 雞胚致死試驗:將待測大腸桿菌分別劃板,挑去平板上的單菌落,與LB液體培養(yǎng)基中37度搖床過夜培養(yǎng),然后離心,經(jīng)PBS洗2次,并用PBS懸液進行倍比稀釋,取0.1ml稀釋液經(jīng)尿囊腔接種12日齡SPF雞胚大約100-300CFU/只,每組10只,同時取0.1ml稀釋液涂板,做細菌計數(shù),對照分兩組,一組直射PBS,一組不注射,計每日死亡數(shù),質(zhì)4d,計胚胎致死率
- 病毒分離:收集病樣加入青霉素(終濃度1000U/ml)和鏈霉素(終濃度1000U/ml),于4℃作用4h以上,取0.2ul接種于9-10日齡雞胚羊膜腔,37℃培養(yǎng)72h,4℃過夜后收集羊水,每份樣品接種3枚雞胚,采集的羊水用1%雞紅細胞進行血凝試驗,判斷病毒是否成功分離,如果標本呈陽性,采用血凝抑制試驗進一步堅定,標本呈陰性則繼續(xù)自傳3代