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      高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒說明書
      更新時(shí)間:2019-02-13 點(diǎn)擊量:2289

      高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒

      HighPure Rapid Mini Plasmid Kit

      保存條件:本試劑盒在室溫儲存 18 個(gè)月不影響使用效果。產(chǎn)品介紹:

      本試劑盒采用改進(jìn) SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低

      pH 值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒 DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除,后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒 DNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。

      產(chǎn)品特點(diǎn):

      1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口特制吸附膜,柱與柱之間吸附量差異極小,可重復(fù)性好??朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

      2. *的去蛋白液配方,可以去除殘留的核酸酶,即使是核酸酶含量豐富的菌株JM 系列、HB101 也可以輕松去除。有效防止了質(zhì)粒被核酸酶降解。

      • 快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯防等試劑,也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好, 可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

      注意事項(xiàng):

      • 次使用時(shí),將試劑盒所帶的全部 RNase A 加入溶液 P1 終濃度 100ug/ml置于 2-8℃保存。如果溶液 P1 RNase A 失活,提取的質(zhì)??赡軙形⒘?RNA 留,在溶液 P1 中補(bǔ)加 RNase A 即可。
      • 環(huán)境溫度低時(shí)溶液 P2 SDS 可能會析出渾濁或者沉淀,可在 37℃水浴加熱幾 min, 即可恢復(fù)澄清,不要劇烈搖晃,以免形成過量的泡沫。

      3. 避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。

      • 溶液 P3 和去蛋白液 PE 中含有刺激性化合物,操作時(shí)要戴乳膠手套,避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí),要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
      • 提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒,建議種單菌落于 1.5-4.5ml 加合適抗生素的 LB 培養(yǎng)基, 過夜培養(yǎng) 14-16 個(gè)小時(shí),可提取出多達(dá) 20µg 的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于 10kb 的大質(zhì)粒,應(yīng)適當(dāng)加大菌體使用量,使用 5-10ml 過夜培養(yǎng)物,同時(shí)按比例增加 P1、P2、P3 的用量,其它步驟相同。
      • 得到的質(zhì)粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260 1 相當(dāng)于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶,也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶,這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動位置不一造成,與提取物培養(yǎng)時(shí)間長短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超90%。
      • 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA,不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫, 但應(yīng)該確保 pH 大于 7.5,pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在-20℃。質(zhì)粒DNA 如果需要長期保存,可以用 TE 緩沖液洗脫10mM Tris-HCl1mM EDTA, pH 8.0,但是 EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng),使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

      自備試劑:無水乙醇操作步驟:

      提示:

      ð 次使用前請先在漂洗液 WB 和去蛋白液 PE 瓶中加入量無水乙醇,充分混勻,加入后請及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇,以免多次加入!

      ð RNase A 全部加入溶液 P1 中,混勻,每次使用后置于 2-8℃保存。

       

      ð 將溶液 P3 放在冰上預(yù)冷,可以提高產(chǎn)量。

      1. 向吸附柱AC 吸附柱放入收集管中500μl 的平衡液BL,12,000rpm  離心 1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

      2. 1.5-4.5ml 過夜培養(yǎng)的菌液,12,000rpm 離心 30 sec,盡可能的倒干上清,收集菌體。收集超過 1.5 ml 菌液, 可以離心棄上清后,在同一個(gè) 1.5ml 管內(nèi)加入更多的菌液,重復(fù)步驟 1,直到收集到足夠的菌體。

      3. 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀,渦旋振蕩至*懸浮。

      4. 250μl 的溶液 P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次使菌體充分裂解。

      5. 350μl 溶液 P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次,充分混勻時(shí)會出現(xiàn)白色絮狀沉淀,

      13,000rpm 離心 10 min,小心取上清。加入溶液 P3 后應(yīng)該立即混勻,以免產(chǎn)生 SDS

      的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清

      6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 吸附柱放入收集管中,12,000rpm 離心 30-60

      sec,倒掉收集管中的廢液可選步驟:加入 500μl 去蛋白液 PE,12,000rpm 離心 30-60

      sec,棄廢液。此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質(zhì),如所用菌株為 JM 系列、HB101 endA 菌株或野生型菌株,核酸酶含量豐富,應(yīng)加此步驟;如所用菌株為 XL-1 Blue DH5α等缺陷型菌株,核酸酶含量低,則可略過此步驟。

      7. 加入 500μl 漂洗液 WB請先檢查是否已加入無水乙醇!,12,000rpm  離心 30 sec,棄掉廢液。

      8. 重復(fù)步驟 7。

      9. 將吸附柱 AC 放回空收集管中,12,000rpm 離心 2 min,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。                                              10.取出吸附柱 AC,放入一個(gè)干凈的離心管中,室溫放置幾分鐘。

      11.在吸附膜的中間部位50μl-100μl 洗脫緩沖液 EB洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好,室溫放置 2 min,12,000rpm  離心 1 min。如果需要較多量質(zhì)粒,

      可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,離心 1 min。洗脫體積越大,洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高,可以適當(dāng)減少洗脫體積, 但是小體積不應(yīng)少于 50μl體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率,減少質(zhì)粒產(chǎn)量。若用ddH2O 做洗脫液,應(yīng)保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內(nèi),pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。

       

      線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書

      Tris-硼酸電泳粉劑(5×TBE)

      胰蛋白酶-EDTA 溶液(0.05%:0.02%,含酚紅)

      滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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