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Na+K+- ATP酶活性測定說明書(分光光度法)
貨號:YJ2218
規(guī)格:100管/48樣
產(chǎn)品簡介:
Na+K+- ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。
Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷,通過測定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性。
自備的儀器和用品:
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板跑、研缽、冰和蒸餾水。
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前加入6ml蒸餾水充分混勻待用;用不完的4℃保存一周。
試劑三:液體 2ml×1 瓶,4℃保存。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。用時加入3mL蒸餾水4℃保存。
試劑五:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入25ml蒸餾水,溶解后4℃保存一周。
試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時加入25ml蒸餾水,溶解后4℃保存一周。
試劑七液體25ml×1瓶,室溫保存。
試劑八:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑八 20倍稀釋,即取 0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制:按H2O:試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
樣品酶液的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液,超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:稱取約0.1g組織,加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
操作步驟:
| 對照管 | 測定管 |
試劑一(μL) | 65 | 45 |
試劑二(μL) | 60 | 60 |
試劑三(μL) | 40 | 20 |
樣本(μL) | 40 | 100 |
混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴10min
試劑四(μL) | 25 | 25 |
樣本(μL) | 100 |
|
混勻,8000g,常溫離心10min,取上清液
| 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | A管 | B管 |
0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液(μL) |
| 20 |
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上清液(μL) |
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| 20 | 20 |
蒸餾水(μL) | 20 |
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定磷試劑(μL) | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻,室溫放置30min,在 660nm處,記錄各管吸光值。
注意:
計算:
定義:規(guī)定每小時每毫升血清(漿)中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力(U/mL)= (C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷V樣÷T
=7.5×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
定義:規(guī)定每小時每毫克組織蛋白中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力(U/mg)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷(Cpr×V樣)÷T =7.5×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
定義:規(guī)定每小時每克組織中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力(U/g)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=7.5×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
定義:規(guī)定每小時每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力(U/104)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×V總÷(V樣÷V樣總×500)÷T=0.015×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V總:酶促反應(yīng)總體積,0.25mL;V樣:加入樣本體積,0.1mL ;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,1/6小時;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。