ELISA應(yīng)用的一些說明：克服非特異性吸附

在ELISA中，非特異性吸附是值得注意的問題，如果抗原或抗體純化不過關(guān)，產(chǎn)生非特異性吸附是實(shí)驗(yàn)操作中無法避免的。

但是，即使抗原抗體的純化達(dá)到一定水平，還是有可能產(chǎn)生非特異性吸附。例如塑料載體表面的吸附，為了避免非特異性顯色，需用含Tween20的PBS或生理鹽水作為洗脫液，吐溫 （Tween）就是指聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)它與聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而進(jìn)行吐溫編號(hào)，結(jié)合月桂酸的為吐溫20，結(jié)合棕櫚酸的為溫40，結(jié)合硬脂酸的為吐溫60，結(jié)合油酸的為吐溫80。在免疫酶技術(shù)中常用含吐溫20的PBS作洗滌劑或作稀釋樣品和酶標(biāo)抗體（抗原）之用，它的洗滌效果要比牛血清蛋白溶液（0.5%）好，具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。吐溫20的使用量一般在0.06%-0.1%.有學(xué)者認(rèn)為，Tween20還有增強(qiáng)特異性反應(yīng)的作用。另外，檢測(cè)血清和酶標(biāo)記抗體用含0.5%-1%牛血清白蛋白（或0.1%白明膠）稀釋也能得到增強(qiáng)特異性吸附的作用。樣品首先用稀釋的健血清孵育，也有助于去除非特異性顯色。除此之外，反應(yīng)的時(shí)間和掌握反應(yīng)劑zui適濃度，也有助于克服非特異性吸附。反應(yīng)一般需4~5h（25℃），如要減少反應(yīng)時(shí)間則可升至37℃，雖然反應(yīng)溫度為37℃時(shí)對(duì)靈敏性和準(zhǔn)確性稍有影響，但是減少了保溫時(shí)間（需2~3h），對(duì)結(jié)果影響并不大，因此，37℃被經(jīng)常采用。酶標(biāo)記抗體的濃度太高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性；太低，則不靈敏。所用待測(cè)樣品、酶標(biāo)記抗體和抗抗體的zui適濃度，通過實(shí)驗(yàn)才能獲得。在一定范圍內(nèi)，ELISA的反應(yīng)強(qiáng)度與待測(cè)樣品濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，通過一系列不同稀釋度的待測(cè)樣品的測(cè)定，才能得出待測(cè)樣品的zui適稀釋度范圍。另外，由于加入固相載體進(jìn)行致敏的抗原量過多，因而造成的前帶（prozone）效應(yīng)，也可以通過測(cè)試抗血清的稀釋度而消除，因?yàn)樵诳贵wzui適量的情況下，多余的抗原也不起干擾作用。關(guān)于酶標(biāo)記抗體的zui適濃度，可以通過劑量反應(yīng)曲線（一系列稀釋的陽(yáng)性和陰性血清，與同一濃度的酶標(biāo)記抗體反應(yīng)），選擇同一稀釋度的陽(yáng)性和陰性血清分別對(duì)不同稀釋度的酶標(biāo)記抗體反應(yīng)而確定。陽(yáng)性血清的吸收值與陰性血清的吸收值之比為zui大值時(shí)，酶標(biāo)記抗體的濃度為zui適濃度。