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      人活性氧(ROS)ELISA試劑盒說明書
      更新時(shí)間:2012-08-14 點(diǎn)擊量:1624

      人活性氧(ROS)ELISA試劑盒說明書

      本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于測定人血清,血漿及相關(guān)液體樣本活性氧含量。提供免費(fèi)代檢測服務(wù)。

      實(shí)驗(yàn)原理

      本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本活性氧水平。用純化的活性氧抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入活性氧,再與HRP標(biāo)記的活性氧抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的活性氧呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品活性氧濃度。

      試劑盒組成

      試劑盒組成

      48孔配置

      96孔配置

      保存

      說明書

      1

      1

      封板膜

      2片(48

      2片(96

      密封袋

      1個(gè)

      1個(gè)

      酶標(biāo)包被板

      1×48

      1×96

      2-8℃保存

      標(biāo)準(zhǔn)品:9 ng/mL

      0.5ml×1

      0.5ml×1

      2-8℃保存

      標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

      1.5ml×1

      1.5ml×1

      2-8℃保存

      酶標(biāo)試劑

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      樣品稀釋液

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      顯色劑A

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      顯色劑B

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      終止液

      3ml×1

      6ml×1

      2-8℃保存

      濃縮洗滌液

      20ml×20倍)×1

      20ml×30倍)×1

      2-8℃保存

      樣本處理及要求

      1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

      2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

      3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

      4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBSPH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

      5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBSPH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

      6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

      7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

      操作步驟

      1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔,在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl,然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為6ng/mL,4 ng/mL ,ng/mL,1ng/mL0.5 ng/mL)。

      2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。

      3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

      4. 配液:將3048T20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水3048T20倍)倍稀釋后備用。

      5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

      6. 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外

      7. 溫育:操作同3。

      8. 洗滌:操作同5

      9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘. 

      10. 終止:每孔加終止50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

      11. 測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值) 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

      注意事項(xiàng):

      1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

      2. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

      3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

      4. 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計(jì)算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

      5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

      6. 底物請避光保存。

      7. 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

      8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

      9. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

      10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準(zhǔn)。

      計(jì)算

      以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),    

      在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD      

      值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋      

      倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)      

      準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD      

      代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋      

      倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。                  

        

                                                    

      試劑盒性能:

      1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。

      2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%11%

               

      保存條件及有效期:

      1.試劑盒保存:;2-8。

      2.有效期:6個(gè)月

       

      滬公網(wǎng)安備 31011802001677號(hào)

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