沙丁胺醇

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物沙丁胺醇將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗沙丁胺醇抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物沙丁胺醇的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物沙丁胺醇的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min～15min
• 樣本檢測下限

尿     樣        ······························· 0.1ppb

組 織（處理法一） ····························· 0.4ppb

組 織（處理法二） ····························· 0.1ppb

飼      料      ·······························  1ppb

• 交叉反應率

沙丁胺醇（Salbutamol ）·······················  100%

特pu他林（Terbutalin）   ·····················  <1%

克倫特羅（Clenbuterol）  ·····················  <1%

萊克多巴胺（Ractopamine）············ ······· <0.1%

• 樣本回收率

尿     樣   ·······························  95%±17%

組     織   ·······························  75%±22%

飼     料   ·······························  80%±18%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙酸乙酯、乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、甲醇、無水硫酸鈉、正己烷

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

• 樣本前處理需配制：

配液1  0.1M HCl 溶液

取0.86ml濃HCl加水定溶至100ml。

配液2  0.1M NaOH 溶液

稱取0.4g NaOH加水定溶至100ml。

配液3  乙腈-0.1M HCl 溶液

        V_乙腈：V_HCl =84：16。

配液4  樣本提取液

        1份20×樣本提取液 + 19份去離子水混合均勻后用于組織樣本提取。

• 樣本處理：

（a）尿樣本的處理方法

取20µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

（b）組織樣本的處理方法一

• 稱2±0.05g均質后的組織至50ml離心管中，加入6ml稀釋后的樣本提取液，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min(注：若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)；
• 取20µl上層液進行分析。 

樣本稀釋倍數(shù):  4倍 

（c）組織樣本的處理方法二

• 稱取 2 ± 0.05g 均質后的組織于50ml離心管中，加入6ml乙腈-0.1MHCl，振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min；
• 取上清3ml，加入2ml 0.1M NaOH，加入6ml乙酸乙酯，振蕩1min，室溫4000r/min 以上離心10min。取全部上清于50～60℃氮氣流或空氣流吹干；
• 加入1ml稀釋后的樣本提取液溶解干燥后的殘留物，混合30s；
• 取20 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：  1倍  

（d）飼料處理方法

• 稱1.0±0.05g研碎的飼料樣品于50ml離心管中，加入10ml甲醇，再加入5g無水硫酸鈉，充分振蕩2min；15℃ 4000r/min以上離心10min；
• 吸出離心后的上清液1ml，于50～60℃氮氣流或空氣流吹干，用1 ml稀釋后的樣本提取液溶解干燥后的殘留物，再加入1ml正己烷混合30s ；15℃ 4000r/min以上離心5min；去除上層有機相；
• 取下層20 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10     

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
• 加標準品/樣本20µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入80µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應30min。
• 將孔內液體甩干，用稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含沙丁胺醇量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中沙丁胺醇實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第yi個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以沙丁胺醇標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中沙丁胺醇實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?/span>

八、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
• 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。
• 該試劑盒jia反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質期

• 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
• 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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