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單核細(xì)胞增生李斯特菌核酸檢測(cè)試劑盒 (PCR法)
【產(chǎn)品概述】
李氏桿菌病是由單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的一種急性或慢性傳染病。本病可分為子宮炎型、敗血型和腦炎型。在家畜中,綿羊的李氏桿菌病最為常見(jiàn),并幾乎全為腦炎型,各種年齡和性別的綿羊都可患?。粩⊙烷g或發(fā)生于10日齡以下的羔羊;子宮炎型多發(fā)生于懷孕最后兩個(gè)月的頭胎綿羊。山羊的病型與綿羊的相同。
本試劑盒應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法,可快速、準(zhǔn)確地定性檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA,適用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【檢測(cè)原理】
以提取的待檢樣本的DNA為模板,在PCR反應(yīng)體系中,低溫條件下引物與互補(bǔ)的模板形成雙鏈,72℃時(shí)在Taq DNA 聚合酶作用下,以dNTP 為原料,以引物為復(fù)制的起點(diǎn),沿模板合成一條新鏈。每個(gè)循環(huán)包括:高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)過(guò)程。每一次循環(huán)使擴(kuò)增的DNA 片段拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過(guò)35 次循環(huán),使擴(kuò)增的DNA 片段放大了數(shù)百萬(wàn)倍以上。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)核酸染料染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見(jiàn)到DNA 片段的擴(kuò)增帶。
【試劑盒組成】
組成成份 | 包裝規(guī)格 |
核酸擴(kuò)增試劑 | |
PCR反應(yīng)液 | 784μl×1管 |
PCR酶 | 16μl×1管 |
質(zhì)控品 | |
陰性質(zhì)控品 | 40μl×1管 |
陽(yáng)性質(zhì)控品 | 40μl×1管 |
* 質(zhì)控品說(shuō)明:陰性質(zhì)控品用于對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控,陽(yáng)性質(zhì)控品用于對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行監(jiān)控。
【自備物品】
1. 儀器:分析天平、離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器等;
試劑:DNA提取試劑、核酸染料(如EB、GoldView II)、DNA Marker(如TaKaRa 1. DL2000)、Loading Buffer、1×TAE(電泳緩沖液)、瓊脂糖、雙蒸水等;
2. 耗材:稱量紙、吸頭、量筒、500ml錐形瓶等。
【使用方法】
注:所有試劑使用前須*解凍,混合均勻后于5,000rpm離心數(shù)秒后使用。
1. 樣本處理(樣本處理區(qū))
待檢樣本的核酸提取可采用核酸提取試劑盒,具體提取方法請(qǐng)參照相應(yīng)說(shuō)明書(shū);陽(yáng)性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品無(wú)需提取,已包裝在試劑盒內(nèi),可直接使用。
2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(配液區(qū))
取N個(gè)(N=陰性質(zhì)控品+待檢樣本+陽(yáng)性質(zhì)控品)PCR反應(yīng)管,每管分別加入PCR反應(yīng)液19.6μl、PCR酶0.4μl (也可按照每頭份用量,計(jì)算N+1頭份PCR反應(yīng)液、PCR酶各自所需總量,兩者混勻離心后分裝20μl至單個(gè)PCR反應(yīng)管)。
組分 | 每頭份用量 |
PCR反應(yīng)液 | 19.6μl |
PCR酶 | 0.4μl |
擴(kuò)增試劑加好后將所有PCR反應(yīng)管于5,000rpm離心10s,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本核酸提取物、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品各5μl,蓋緊管蓋,于5,000rpm離心10s,轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū)。
4. PCR擴(kuò)增(檢測(cè)區(qū))
94℃ 3min;
94℃ 30s
55℃ 30s
72℃ 30s
72℃ 7min;
4℃ Hold;
設(shè)置25μl體系。
5. 電泳檢測(cè)(電泳區(qū))
稱4g瓊脂糖放于500ml錐形瓶中,加入200ml 1×TAE電泳緩沖液,于微波爐中熔解,室溫冷卻10min后加入10μl核酸染料混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10~20μl,加入終濃度1×的上樣緩沖液,點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中,100~120V電壓在1×TAE電泳緩沖液中電泳至溴酚藍(lán)處于凝膠1/2處(約30min),紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)320bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)該位置的特異條帶出現(xiàn)(引物帶除外),實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立,否則視為無(wú)效。被檢樣品出現(xiàn)320bp擴(kuò)增帶為單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性,否則為陰性。
【注意事項(xiàng)】
1. 有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請(qǐng)嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門(mén)頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。
2. 實(shí)驗(yàn)請(qǐng)嚴(yán)格分區(qū)操作:流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→樣本提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。
3. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前,充分融化后請(qǐng)稍事離心。
4. 在-20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物,應(yīng)在加樣前置室溫解凍,作短暫離心后使用。
5. 核酸染料低毒,應(yīng)于室溫條件避光保存,操作時(shí)應(yīng)戴上手套,染料和上樣緩沖液使用前也請(qǐng)離心使液體沉于管底。
6. 嚴(yán)格遵守操作說(shuō)明可以獲得最H的結(jié)果。操作過(guò)程中移液、定時(shí)等全部過(guò)程必須精確。
7. 反復(fù)凍融試劑將減低檢測(cè)靈敏度,建議在3次內(nèi)用完,請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃保存,避免反復(fù)凍融,有效期6個(gè)月。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
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