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      流感病毒H5亞型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)
      更新時間:2021-12-23 點擊量:1227

      流感病毒H5亞型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

       

      【產(chǎn)品名稱】

      通用名稱:q流感病毒H5亞型檢測試劑盒檢測試劑盒(實時熒光PCR法)

      英文名稱Avian Influenza Virus H5 hemagglutinin subtypes Detection Kit (Real-Time PCR Method)

      【包裝規(guī)格】 25T/& 50T/

      【預(yù)期用途】

      本試劑盒適用于q流感病毒H5亞型檢測,可用于臨床q流感感病毒H5亞型感染的輔助診斷,但不作確診使用。

      【檢驗原理】

      本試劑盒針對q流感病毒H5亞型基因組高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含q流感病毒H5亞型基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

      【主要組成成份】

      序號

      組成

      25T/

      50T/

      1

      q流感H5 RT-PCR反應(yīng)液

      375 μL×1

      750 μL×1

      2

      q流感H5逆轉(zhuǎn)錄酶

       50 μL×1

      100 μL×1

      3

      q流感H5 Taq

       75 μL×1

      150 μL×1

      4

      q流感H5陽性對照

       40 μL×1

       40 μL×1

      5

      q流感H5陰性對照

       40 μL×1

       40 μL×1

      6

      說明書

      1

      1

      注:陰性對照為人基因組DNA,陽性對照為失去活性的q流感病毒H5亞型cDNA。

      【儲存條件及有效期】避光-20以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。

      【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCyclerRotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

      【樣本要求】

      1.取咽喉拭子、泄殖腔拭子或血液樣本,禽肉取肌肉或內(nèi)臟樣本,樣本處理方法參照相關(guān)文獻資料。

      2.樣本采集后應(yīng)立即檢測,若不能立即檢測,應(yīng)置于-80冷凍保存,避免反復(fù)凍融,用干冰或液氮運輸。

      【檢驗方法】

      1. 試劑準備(試劑準備區(qū))

      1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

      2)核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

      n =陰性對照數(shù)(1T+陽性對照數(shù)(1T+誤差預(yù)留量(1T+樣本數(shù)

      單反液配制表1T

      RT-PCR反應(yīng)液

      15.0 μL

      逆轉(zhuǎn)錄酶

       2.0 μL

      Taq

       3.0 μL

      3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

      2.樣本準備(樣本處理區(qū))

      公司病毒核酸 提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。

      3.加樣

      在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA5 μL、終體積25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng),混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng)混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

      4.PCRPCR擴增區(qū))

      1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。

      反應(yīng)體積

      25 μL

      通道選擇

      FAM通道采集q流感H5亞型熒光信號

      PCR

      反應(yīng)

      條件

      步驟

      條件

      循環(huán)數(shù)

      反轉(zhuǎn)錄

       4210分鐘(min

      1

      預(yù)變性

      953分鐘(min

      1

      預(yù)擴增

      955秒(s

      5

      5540秒(s

      PCR擴增

      955秒(s

      40

      5540秒(s

      (此階段結(jié)束時采集熒光信號)

      2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

       

       

       

      注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團選擇None

       

      【陽性判斷值或者參考區(qū)間】

      1.試劑盒有效性判定:

      1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct≤35。

      2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。

      2.標本結(jié)果判定:

      1陽性:標本檢測結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長期。

      2)可疑:標本檢測結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。

      3)陰性:標本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。

      【檢驗結(jié)果的解釋】

      通道及檢測結(jié)果

      標本檢測結(jié)果解釋

      FAM

      陽性(+

      標本中檢出q流感病毒H5亞型RNA

      陰性(-

      標本中未檢出q流感病毒H5亞型RNA

      【檢驗方法的局限性】

      1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

      2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

      3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果。

      【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV≤5%。

      【注意事項】

      1. 整個檢測過程應(yīng)嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用,不能混用;實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭;樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,樣本處理在生物安全柜中進行操作;三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

      2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4條件下操作,且完成實驗后立即上機檢測;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。

      3. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。

      4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,并應(yīng)瞬時離心。

      5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),并單獨存放。

      6. 為防止熒光干擾,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記。

      7. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置;不同批號試劑不能混用。

      8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,淬滅基因選擇None。

      9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄。


       

       

       

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