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021-65232515
本試劑盒只能用于科學研究,不得用于醫(yī)學診斷
伏馬毒素(Fumonisin)ELISA檢測試劑盒
使用說明書
檢測原理
試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被伏馬毒素抗原的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的競爭抗原,經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的伏馬毒素(Fumonisin)呈負相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
3. 細胞上清液:3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1.酶標儀(450nm)
2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結晶*溶解后再使用。
2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
3. 按照說明書操作時樣本已經稀釋5倍,最終結果乘以5才是樣本實際濃度。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無 |
標準品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 無 |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 |
競爭抗原-HRP | 6mL | 3mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個 | 1個 | 無 |
注:標準品(S0-S5)濃度依次為:0、0.25、0.5、1、2、4 PPb
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板:甩盡孔內液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
2. 自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
3. 樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。
4. 除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的競爭抗原50μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。
結果判斷
1. 15分鐘內在波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值;
2. 百分結合率計算:設S0管計數(shù)為B0,各標準管或樣品管計數(shù)為B,非特異管計數(shù)為NSB,則百分結合率計算公式如下:B/B0=(B-NSB)/(B0-NSB)×100%
3. logit計算:各標準點或樣品管的logit值計算公式如下:logit=ln(B/B0)/(1-B/B0)
4. 將標準品的OD均值與標準品0點的OD均相除,為標準點的百分結合率,在log-logit坐標紙上繪圖。
5. Log-logit雙對數(shù)標準曲線:坐標紙上橫軸從左至右第一個1-9表示為第一個10進位,第二個1-9表示為第二個10進位。第三個1-9表示為第三個10進位。坐標紙縱軸為百分比(1-99),即各標準吸光值的百分結合率。取一條通過各點的直線。要求盡可能多的點在線上,同時剩余的點均勻分布在直線的兩邊。樣品也同樣由吸光值計算百分結合率,再從縱軸上的相應結合率找到直線上的點,此點對應的橫坐標濃度即為樣品的濃度,無須換算。
6. 人工處理:以標準濃度取log值為橫坐標,對應的logit值為縱坐標在普通坐標紙上或以標準濃度為橫坐標,對應的B/B0為縱坐標在logit-log坐標紙上畫出標準曲線(理想化時是一條直線)。根據(jù)待測樣
品的B/B0可以從坐標紙上查出樣品的濃度值。如果使用普通坐標紙,查出的數(shù)值應取反對數(shù)才是最后的濃度值。
7. 自動處理:使用logit-log或四參數(shù)數(shù)據(jù)處理模式,由電腦自動計算得出結果。
8. 敏感度:0.1 PPb
9. 圖例
試劑盒性能
1. 準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值,大于等于0.9900。
2. 靈敏度:最DI檢測濃度小于0.1 PPb。
3. 特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4. 重復性:板內、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
6. 有效期:6個月
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