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α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性檢測試劑盒說明書
注意:正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
貨號:100T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
微量法
試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入 2.5mL 雙蒸水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二:液體 4mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。
標準液:液體 1mL×1 支,4℃保存,5μmol/mL 對硝基苯酚溶液。
產(chǎn)品說明:
α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,能專一地催化α半乳糖苷鍵的水解,主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL
對于植物種子的萌發(fā)至關重要,種子萌發(fā)初期,其催化產(chǎn)生的 D-半乳糖通過糖酵解途徑迅速轉(zhuǎn)化和消耗,為種子的萌發(fā)提供最初的能量來源,后期則主要參與細胞壁儲藏多糖水解。
α-GAL 分解對-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算α-GAL 活性。
試驗中所需的儀器和試劑:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、粗酶液提取:
1、細菌或培養(yǎng)細胞的處理:收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復30 次),15000g,4℃,離心 20 分鐘,取上清,置冰上待測。
2、組織的處理:稱取約 0.2g 組織,加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿;15000g,4℃,離心 20 分鐘, 取上清,置冰上待測。
3、標準液的處理:用蒸餾水將標準液稀釋至 200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL.
二、測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 400nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定,(在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標準管 |
試劑一 | 25 | ||
蒸餾水 | 25 | ||
試劑二 | 35 | 35 | |
樣本 | 10 | 10 | |
迅速混勻,放入 37℃保溫 30min | |||
標準液 | 70 | ||
試劑三 | 130 | 130 | 130 |
充分混勻, 400nm 處測定吸光值 A,計算ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設一個對照管。三、α-GAL 活性計算:
根據(jù)標準管的吸光度(x,減去濃度為 0 的標準管 OD 值)和濃度(y,nmol/mL)建立標準曲線,將△A 帶入標準曲線中,計算樣品生成的產(chǎn)物量(nmol/mL)。
1.按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=14×y÷Cpr 需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
2.按樣本鮮重計算:
單位的定義:每 g 組織每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-GAL 活力(nmol/h /g 鮮重)=(y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=14×y ÷W
3.按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-GAL 活力(nmol/h /104 cell)= (y×V 反總)÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.028×y
Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;V 反總:反應體系總體積,0.07mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.01mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣本質(zhì)量,g; 500:細胞或細菌總數(shù), 500 萬;T:反應時間,0.5h。
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