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抗原的固定
組織細(xì)胞內(nèi)抗原的固定是免疫酶標(biāo)和非標(biāo)記免疫酶組織化學(xué)方法中的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)過(guò)固定,可以達(dá)到如下目的:1.標(biāo)本在玻片上的吸著力增加;2.標(biāo)本所含的類脂和蠟質(zhì)等成分可以除去,從而有利于抗原與酶標(biāo)記抗體的結(jié)合;3.標(biāo)本的保存時(shí)間可以增長(zhǎng),組織切片固定后,在-20℃,可以存放一年以上而不改變免疫酶技術(shù)的染色;組織內(nèi)有關(guān)抗原不同,則所用固定劑與固定方法也隨之改變。
丙酮和乙醇是常用的兩種固定劑。但對(duì)于許多病毒與細(xì)菌的定位研究,選擇丙酮和四氯化碳作為固定劑是zui合適的;對(duì)于可溶性蛋白抗原的定位,常用乙醇;對(duì)于多糖,則用8%-10%福爾馬林,而不用乙醇與丙酮等有機(jī)溶劑。
對(duì)于那些在表面覆蓋蛋白衣膜的抗原,還常用胰蛋白酶、黏蛋白酶、透明質(zhì)酸酶以及受體破壞酶進(jìn)行處理。有人報(bào)道,苦味酸-甲醛固定液應(yīng)用于肝組織內(nèi)甲種胎兒蛋白酶標(biāo)定位能獲得滿意結(jié)果。
對(duì)于植物病毒材料的固定,丙酮用得zui多,乙醇次之。因?yàn)楸獙?duì)病毒的抗原性損害為zui小,但對(duì)于那些不穩(wěn)定的病毒,則應(yīng)避免固定。
在應(yīng)用免疫酶技術(shù)時(shí),固定處理對(duì)酶的活性的影響也得心中有數(shù)。許多固定劑對(duì)抗原的活性都 會(huì)有所損害,例如,福爾馬林對(duì)蛋白抗原的固定造成抗原性的破壞非常明顯。因此,對(duì)福爾馬林的使用必須嚴(yán)格控制濃度,一般使用的福爾馬林濃度為10%,盡管如此,對(duì)抗原的抗原性還是有損害,所以必須進(jìn)行抗原修復(fù)。
另外,對(duì)于堿性磷酸酶,在4℃下,丙酮固定一晝夜,能喪失30%的活性,如用丙酮固定后包埋,則喪失70%的活性;在4℃下,福爾馬林固定2-4h,則喪失25%的活性。
固定條件對(duì)標(biāo)本的固定效果作用較大。
固定劑濃度:丙酮zui常用的是100%;乙醇zui常用95%,但是70%乙醇的固定力為zui強(qiáng);福爾馬林常用10%。
固定的溫度:一般而言,固定作用隨溫度升高而加強(qiáng),室溫是zui常用的。固定溫度可以-70-30℃。應(yīng)根據(jù)不同的抗原使用不同的溫度,麻疹病毒應(yīng)在-20-40℃用丙酮固定30min,而酶可以37℃用乙醇固定15min.
固定液的pH:一般以所用固定劑的pH為準(zhǔn),但若以酶去除某些抗原表面的蛋白衣膜時(shí),應(yīng)根據(jù)所用酶的性質(zhì)調(diào)節(jié)pH。
固定時(shí)的干濕度:干濕度一般情況下不需考慮,但某些材料在固定時(shí)受干濕度影響很大。丙酮對(duì)Hela 細(xì)胞中的灰質(zhì)炎病毒固定,在室溫干燥的情況下,N抗原就轉(zhuǎn)變?yōu)?span lang="EN-US">H抗原;而在-20℃不干燥的情況下,N抗原保持不變。
固定的時(shí)間:有長(zhǎng)有短,一般在室溫下,固定15min左右,低溫下固定30min.如僅為了使材料不脫落為了減輕未處理的新鮮冰凍切片出現(xiàn)的空泡,則可用丙酮、乙醇和甲醛作短時(shí)間處理。
固定后的沖洗:固定后的材料常用中性磷酸緩沖液反復(fù)沖洗,以免在固定過(guò)程中可能彌散出來(lái)的物質(zhì)覆蓋表面。
固定標(biāo)本的保存:標(biāo)本材料經(jīng)固定后,要立即使用于免疫酶技術(shù)中,不要久貯。如實(shí)在要保存,應(yīng)置于冰箱(4℃)中,在干燥的情況下24h內(nèi)抗原性損失不大。在-20℃下,冰凍切片或涂片可保存1周到1個(gè)月,石蠟切片可保存數(shù)月以上。在-20℃下保存時(shí),為了防止形成過(guò)多的冰結(jié)晶并發(fā)生組織細(xì)胞的變化,應(yīng)將切片浸入聚乙烯醇甘油溶液中,讓其在-20℃下形成固態(tài)保護(hù)膜,然后在免疫酶染色前用手指加溫,用生理鹽水輕輕洗去,每次5min,共洗3次。這樣保存的標(biāo)本,污染增多。某些干燥標(biāo)本(例如組織內(nèi)阿米巴抗原、組織自身抗原)貯于辛烷中可長(zhǎng)期保存(-30℃),并且?guī)缀鯚o(wú)污染。
固定的程序很簡(jiǎn)單,將固定劑用吸管加到標(biāo)本上去,或?qū)?biāo)本置于玻片架上浸入固定劑溶液中,固定后立即用磷酸緩沖液沖洗,然后在空氣中晾干或風(fēng)扇吹干。
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