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      pUC-T TA快速連接試劑盒(含載體,連接酶)說明書
      更新時間:2020-12-23 點擊量:971

        

       

      pUC-T TA快速連接試劑盒(含載體,連接酶)說明書

       

      pUC-T Quick Ligation Kit

      pUC-T TA快速連接試劑盒(含載體,連接酶)

       

      目錄號:YJ2591

       

       

      保存條件:-20℃保存。

       

      組分說明

       

                      Cat. No.                            YJ2591

                      Size                                  20次

                      pUC-T(50 ng/μl)                       20 μl

                      Conctrol Insert (50 ng/μl)            10 μl

                      Quick T4 DNA Ligase                   20 μl

                      2×Quick Ligation Reaction Buffer     120 μl

       

       

                    本產品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  

       

       

      產品簡介

       

        pUC-T TA載體是一種克隆PCR產物的載體,它是由pUC18載體在EcoR V

      酶切位點處切開,在兩側的3′端添加T而成。由于大部分耐熱聚合酶反應時都會在 PCR

      產物的3′端添加一個A,它可以與pUC-T 3′端的T互補連接,因此可大大提高PCR產物的連接和克隆效率。

       試劑盒中配備率的T4 DNA Ligase和為快速DNA連接優(yōu)化的2×Quick Ligation 

      Reaction Buffer。連接效率相當于用T4 DNA Ligase 進行常規(guī)連接1小時。帶有插入片

      段的重組子可根據α互補原理,進行藍白斑篩選,判斷載體中有無外源基因的插入???/span>

      隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物對PCR產物進行測序。

       

      注意事項

       

      1.Insert DNA 要求

         1)連接使用的PCR片段3’末端應帶有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶,如我公司的  Pfu擴增的PCR產物是平滑末端,可使用加A試劑盒加上A尾后,再進行T載體克隆。

         2)PCR產物建議進行切膠回收純化后再進行T載體克隆,以免PCR產物中的非特異片

         段或殘存引物等雜質影響。推薦使用  YJ2302/YJ0524/YJ0518 快速瓊脂糖凝膠

         DNA回收試劑盒。

      2.連接反應要求

         1)本試劑盒能使大多數連接反應在25℃條件下5分鐘甚至更短時間內達到反應終點,

         增加反應時間反應效率不會增強。如用快速連接反應  1小時后,轉化效率會明顯降

         低;如25℃快速連接反應過夜,則轉化效率會下降到75%。

         2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP,使用前置于冰上使其融化后充分混

         勻,建議初次使用分裝成小管凍存,避免其反復凍融影響DNA連接效率。

         3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油,比較粘稠容易掛壁,建議使用之前短暫離心將

         液體收集到管底,取樣時槍頭盡量不要深入液面太深,以免粘在槍頭上造成損失。

         4)如快速連接產物用于電轉,因快速連接反應體系中的PEG會影響電轉效率,建議

         使用離心柱將連接產物進行DNA純化(如YJ2301快速DNA產物純化試劑盒)后再

         進行電轉。

      3.感受態(tài)細胞要求

         建議使用的熱擊轉化感受態(tài)細胞,這樣才可能得到比較理想的陽性克隆,如需  

         進行藍白篩選,宿主細胞必須具有正確的基因型(F′編碼的【lacZ ΔM15】)產生ω片

         段,才能與載體DNA產生的LacZ  α多肽結合,表現出β-半乳糖苷酶活性(α互補)。

         pUC-T  TA載體以pUC18載體為基礎構建而成,因此,適合pUC18載體的感受態(tài)細胞都可以使用。推薦使用本公司YJ0807 *0感受態(tài)細胞、YJ0808 DH5α感受態(tài)細胞。

      4.陽性克隆篩選

         陽性DNA-片段成功插入至pUC-T Vector中后,一般情況下β-半乳糖苷酶的表達將受

         到破壞,重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時將顯示白 

         色菌落。但有時比較短的DNA-片段插入載體時,基因的讀碼框有可能正好與LacZ的 

         讀碼框相吻合,克隆體也會顯示藍色菌落。

      5.陽性對照

         為了確認實驗操作的正確性,以及實驗試劑的有效性,我們建議使用本試劑盒中配

         備的Control Insert(750 bp)進行陽性對照實驗。

       

      使用方法

       

      1.按以下體系配制反應液:

       

      成分                               反應體系          對照體系

      pUC-T                                 1 μl          1 μl

      DNA插入片段   *                    0.1 -0.3 pmol      --

      Control Insert DNA                       --           1 μl

      2×Quick Ligation Reaction  Buffer     5 μl          5 μl

      Quick T4 DNA Ligase                    1 μl          1 μl

      RNase-Free Water                      補足至 10 μl     補足至 10 μl

       

           *Insert DNA的使用量:在進行克隆時,Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為:1:2-1:10,

           可根據實驗情況選擇適當的Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比。Insert DNA的使用量=nmol數×660×Insert DNA bp數。本載體1 ml(50  ng)的摩爾數約為0.03 pmol。

       

      2.輕輕混合,短暫離心。25℃反應5分鐘。

         注意:反應時間不要超過15分鐘,否則會降低連接效率。

      3.反應結束后,將DNA連接產物存放于0-4℃,而后進行轉化實驗;也可將  DNA連接

         產物置于-20℃保存。

         注意:勿進行加熱失活反應。

      4.將連接產物加入50 μl感受態(tài)細胞中(將感受態(tài)細胞置于冰上融化),冰浴30分鐘。

         注意:用化學法轉化時,連接產物的加入量不要超過感受態(tài)細胞體積的10%。

      5.42℃熱擊45秒鐘,迅速將離心管轉移到冰浴中,冰上靜置2-3分鐘。

      6.加入450 μl無菌SOC或LB培養(yǎng)基,混勻后置于37℃搖床,150 rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘,

         使菌體復蘇。

      7.根據實驗要求,取適量已轉化的感受態(tài)細胞,加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體

         培養(yǎng)基上,用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開,將平板置于37℃,直至液體被吸收后,

         倒置培養(yǎng),37℃培養(yǎng)12-16小時。

      8.計算白、藍色菌落,挑選白色菌落,使用PCR法或酶切法鑒定插入片段是否正確。

       

         

      實驗代做服務:

      ELISA試劑盒免費代檢測

      CCK8檢測

      HE染色

      蛋白相互作用分析

      Western Blot

      免疫組化IHC染色

      熒光定量PCR

      動物模型服務

      流式細胞檢測

      免疫熒光染色

      激光共聚焦

      DNA甲基化實驗

      石蠟/冰凍切片

      透射電鏡服務

      掃描電鏡實驗

      蛋白雙向(2-D)

      動物實驗

      免疫共沉淀

      原位雜交(FIsh)

      蛋白質純化

      分子克隆和質粒載體構建服務

      組蛋白甲基化磷酸化乙?;?/a>

       

      蛋白雙向2D-WB

       

      藥理毒理動物實驗

       

      番紅O固綠染色

      明膠酶譜MMP

      酶活性檢測

      動物造模/模型實驗服務

                                          

      滬公網安備 31011802001677號

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